not available fi se
1 2 3
www.solunetti.fi
klass 3

Immunofluorescens

Med den s.k. FRET-tekniken (fluorescence resonance energy transfer), där man använder olika GFP-varianter, kan man mäta avståndet mellan olika fluorokromer med nanometers noggrannhet. FRET-teknik används vanligen för att mäta avståndsförändringar mellan olika proteindelar eller mellan två olika proteiner inom samma stora strukturprotein in levande celler eller in vitro.

FRET-tekniken bygger på överföring av exitationsenergi från en fluorescerande grupp (givare) till en annan (mottagare) såvida grupperna är tillräckligt nära varandra (1-10 nm). När energin överförs minskar intensiteten i givarens fluorescens och samtigt ökar intensiteten i mottagarens fluorescens. Detta kan mätas. Energiöverföringen mellan de olika grupperna är omvänt proportionell mot avståndet mellan grupperna. På basen av förändringar i fluorescensintensiteten kan man sluta sig till vilka processer, som skett i cellen (t.ex. konformationsförändringar i proteinet), under den tid man studerat den. 

 

 

 

 

 

 

Med FRET-teknik är det också möjligt att följa förloppet vid proteinernas veckning och vid membranernas association-dissociations-processer. Man har till exempel med FRET-teknik följt konformationsförändringarna i samband med att en heterodimer integrinmolekyl aktiveras (alfa- och beta-subenheterna skiljs åt).

 

 

FRET-tekniikkaa voidaan käyttää myös proteiinien laskostumisen tai kalvoilla tapahtuvien assosiaatio-dissosiaatio -prosessien seuraamiseen. Esimerkiksi heterodimeerisessä integriini-molekyylissä aktivoitumisen seurauksena tapahtuvaa konformaation muutosta (alfa- ja beta-alayksiköiden eroamista toisistaan) on seurattu käyttäen FRET-tekniikkaa.