not available fi se
not available 2 not available
www.solunetti.fi
Framsida / Forskning / Molekylärbiologiska metoder / Nukleinsyror mångfaldigas
klass 2

Nukleinsyror mångfaldigas

PCR eller polymeraskedjereaktion (polymerase chain reaction) är en smidig metod för kopiering av DNA. Med hjälp av PCR är det möjligt att utgående från en enda DNA-molekyl göra miljontals kopior. PCR-metoden bygger på ett värmestabilt DNA-polymeras, som påträffats i mikrober som lever i heta källor. Metoden uppfanns av Kary Mullis och i dagens läge finns många olika tillämpningar av den. Den används i laboratorier inom biologi och medicin.

Med hjälp av PCR kan DNA mångfaldigas och dessutom förändras i önskad riktning. Man kan lägga till restrik-tionsenzymer eller mutera vissa enskilda baser i DNA och via dem ändra på aminosyrauppsättningen i proteiner.

Med vanlig PCR-teknik kopieras DNA-fragment som är ungefär 10 kb stora. För reaktionen behövs DNA primers, DNA-polymeras (taq-polymeras), nukleotider, buffert-lösning och joner. Reaktionen sker i ett litet provrör i en apparat som värmer och kyler provröret enligt ett bestämt mönster. Vanligen sker PCR i 20-35 trefasiga cykler. PCR börjar med att DNA upphettas till 95 °C. Härvid separeras DNA-kedjorna från varandra (denaturerar) (se fas 1 i bilden ). Därefter sker en kylning till 50-64 °C, vilket gör det möjligt för primers att exakt binda till komplementära sekvenser på respektive DNA-sträng (2), varefter taq-polymeraset tillsätts och temperaturen höjs till 72 °C, vilket ofta är den optimala arbetstemperaturen för taq-polymeraset. Från enkel-strängat DNA syntetiserar DNA-polymeraset dubbelsträngat DNA (3). Den sista fasen i den tredje cykeln är ofta längre än normalt, för att alla DNA-strängar säkert skall polymerisera till slut.

Bildtext. De olika delarna i en PCR-reaktion.
DNA som skall kopieras
primers
DNA-polymeras
nukleotider (dNTP)
buffertlösning
joner (mn2+ eller Mg2+, K+)