not available fi se
1 2 not available
www.solunetti.fi
Etusivu / Tutkimus / Molekyylibiologisia menetelmiä / Nukleiinihappojen eristys ja puhdistus
taso 2

Gradienttisentrifugointi
   

Nukleiinihappojen eristys ja puhdistus

Nukleiinihappojen puhdistukseen on olemassa useita erilaisia menetelmiä. Kun vesiliuoksessa olevaa näytettä käsitellään esimerkiksi fenolin ja kloroformin seoksella, proteiinit denaturoituvat ja saostuvat fenoli-kloroformin ja vesiliuoksen rajapinnalle ja nukleiinihapot jäävät vesiliuokseen. Myös korkeilla suolapitoisuuksilla saadaan proteiinit saostumaan pois näytteestä.

Myös itse nukleiinihappoja voidaan saostaa näytteestä esimerkiksi alkoholilla (etanoli tai isopropanoli), jolloin epäpuhtaudet jäävät liuokseen ja saostunut nukleiinihappo voidaan liuottaa uudelleen puhtaaseen puskuriliuokseen. Samalla nukleiinihappoja voidaan konsentroida liuottamalla ne alkuperäistä pienempään tilavuuteen. Nukleiinihapot saostuvat vain suoloina, joten alkoholin lisäksi saostuksessa on oltava läsnä myös jotakin kationia (esim. Na-asetaatti).

Sentrifugointia voidaan käyttää nukleiinihappojen puhdistuksessa CsCl-tiheysgradientin kanssa. Sentrifugoitaessa painavat cesium-ionit painuvat kohti putken pohjaa ja synnyttävät tieheysgradientin (pohjalla tiheämpää, pinnalla vähemmän tiheää). Eri muodoissa olevat nukleiinihapot erottuvat tiheysgradientissa sen mukaan, kuinka paljon etidiumbromidia niihin on sitoutunut. Etidiumbromidi on cesiumkloridia kevyempää, joten mitä vähemmän etidiumbromidia molekyyli sitoo, sitä painavampi se on ja sitä syvemmälle gradientissa se painuu sentrifugoinnin voimasta. Tällä tavoin voidaan erottaa esimerkiksi plasmidi-DNA, kromosomaalinen DNA ja RNA. Näistä kromosomaalinen DNA sitoo eniten etidiumbromidia ja on siten kevyintä, superkierteinen plasmidi ei sido niin paljon etidiumbromidia ja on hieman raskaampaa ja yksijuosteinen RNA sitoo vain hyvin vähän etidiumbromidia ja painuu putken pohjalle.

Kromatografiset puhdistusmenetelmät voivat hyödyntää esimerkiksi geelisuodatusta, ioninvaihtokromatografiaa tai valikoivaa sitoutumista. Geelisuodatus perustuu siihen, että erikokoiset molekyylit diffundoituvat geelipylvään läpi eri nopeuksilla. Ioninvaihtokromatografia hyödyntää nukleiinihappojen voimakasta negatiivista varausta. Valikoivaan sitoutumiseen perustuvassa silikapuhdistuksessa nukleiinihappojen annetaan sitoutua korkeassa ionivahvuudessa silikaan, epäpuhtaudet pestään pois ja nukleiinihapot irrotetaan silikasta liuoksella, jossa on matala ionivahvuus. Useissa kaupallisissa nukleiinihappojen puhdistusmenetelmissä silika on pieneen koeputkeen mahtuvan pylvään suodatinkalvossa, jonka läpi näyte ja pesuliuokset sentrifugoidaan.