Näytteenvalmistus
Värjäysmenetelmät
Värjäysmenetelmät
Värinpoisto
Väri voidaan poistaa leikkeestä usealla tavalla:
1. Ylimäärä peittausainetta
Ylimääräisen peittausaineen avulla väri irtoaa peittausaine-väri kompleksista kudoksessa. Väri tulee ylimääräisen peittausaineen mukana pois solukosta. Pidempi aika peittausaineessa liuottaa kaiken värin. Tumat sitovat yleensä enemmän väriä kuin sytoplasma, josta väri poistuu ensiksi, mikä onkin usein toivottu tulos. Reaktio voidaan pysäyttää huuhtomalla leike juoksevalla vedellä. Reaktio on tärkeä pysäyttää, muuten näyte haalistuu kokonaan.
2. Happokäsittely
Hapot poistavat väriä osittain tuntemattomalla mekanismilla.
3. Hapetusmenetelmä
Värit hapetetaan värittömään muotoon. Menetelmä on hidas ja mahdollistaa monien vivahteiden ja värisävyjen muodostumisen. Pikriinihappoa käytetään usein tähän tarkoitukseen.
Parafiinin poisto, hydraatio ja värjäys
Järjestä kaikki valmiiksi ennen aloitusta!
Menetelmä:
1. Laita objektilasit selät vastakkain telineeseen.
2. Laseja pidetään ensin laskevassa alkoholisarjassa: ksyleeni I, ksyleeni II, abs alk, 96% alk, 80% alk, 70% alk, 50% alk, 20% alk, tislattu vesi. Ksyleeni 5 min, muut noin 3 min.
Käsittely on päinvastainen kuin parafiiniin valamisessa. Nyt parafiini on poistettu ja väri tarttuu näytteeseen.
3. Tislatun veden jälkeen näytteet ovat valmiit värjäykseen.
Alla kaksi yleistä värjäysmenetelmää:
Hematoksyliini-eosiini
a. parafiinin poisto ja näytteiden hydraus
b. Delafieldin Hematoksyliini liuos: 4 ml hematoksyliini + 200 ml vesi, 4 tuntia
c. juokseva vesi, 5-10 min
d. Eosiini (gelblich) 0,5%, 5 min
e. juokseva vesi, 1 min
f. 80% alkoholi ja nouseva alkoholi ja ksyleeni ja näytteen petaus
g. tulos: tumat tumman sinisiä; solulima vaaleanpunainen
Heidenhains Azan
a. parafiinin poisto ja hydraus
b. Azokarmiini (hyvin suljetussa astiassa 56-60°C) 45-60 min
c. lasien jäähdytys huoneenlämmössä 5-10 min
d. huuhtelu tislatulla vedellä
e. diffaus aniliiniliuoksella. (Tumien tullessa esiin lopetetaan diffaus).
f. huuhtelu etikkahapolla 1,5-2 min
g. fosforiwolframihappo 1-3 tuntia
h. huuhtelu vedellä
i. Aniliinisini-oranssi-väriliuos 1-3 tuntia
j. huuhtelu vedellä
k. diffaus i 96% alkoholi. (hankalat näytteet, joissa on paljon ohuita säikeitä, voidaan laittaa suoraan alkoholiin)
l. veden poisto nousevalla alkoholisarjalla, kirkastus ksyleenillä, ja petaus
m. tulos: kollageeni ja retikuliini säikeet - voimakkaan sinisiä; kromatiini - punainen; lihas - punaisesta oranssiin; punaiset verisolut - punainen; neurogliia - punertava; lima (esim. suolenpinnalla) - sininen; eriterakkulat - keltainen, punainen tai sininen
4. Värjäyksen loputtua tehdään näytteestä pysyvä ja helposti käsiteltävä:
a. Ensiksi nousevalla alkoholisarjalla poistetaan vesi: 20% alk, 50%, 70%, 96%, abs I, abs II, ksyleeni. Vähintään 3 min kussakin. (Jos värjäysohjeessa sanotaan korkeampi alkoholipitoisuus, ei matalampia pitoisuuksia tarvita)
b. Ksyleeniliuoksesta lasi nostetaan käsipyyhe- tai imupaperin päälle. Pisara petausainetta (Permount) tiputetaan lasille ja peitinlasi laitetaan varovasti näytteen päälle. Peitinlasia painetaan kohti objektilasia, jolloin petausaine leviää tasaisesti lasien väliin. Lasit laitetaan yön yli lämpökaappiin (+37°C), jolloin petausaine kovettuu.
Kirjallisuutta:
Gretchen L. Humason. 1972. Animal Tissue Techniques. W.H. Freeman & Company, San Francisco.
Gertraude Moewis. 1978. Histopatologisk teknik. Almqvist & Wiksell Förlag Stockholm
Benno Romeis. 1968. Mikroskopische Technik. R. Oldenbourg Verlag, München, Wien.
