not available fi se
not available 2 not available
www.solunetti.fi
taso 2

Digestio (restriktioentsyymien käyttö)

Restriktioentsyymit ovat entsyymejä, jotka katkaisevat DNA:ta tietyn, lyhyen (yleensä 4 - 6 emästä) sekvenssin kohdalta. Jotkut restriktioentsyymit tuottavat DNA:han kohessiiviset päät (eli juosteet eivät katkea saman emäsparin kohdalta vaan jäävät hieman erimittaisiksi) ja jotkut tylpät päät (eli molemmat juosteet katkeavat saman emäsparin kohdasta). Restriktioentsyymit ovat bakteerien endonukleaaseja, joiden avulla ne hajottavat soluun tunkeutuvaa virus-DNA:ta ja siten rajoittavat (engl. restrict) virusten lisääntymistä.

Restriktioentsyymejä käytetään hyödyksi esimerkiksi kloonauksessa, jolloin kloonattava geeni voidaan siirtää kloonausvektoriin (esimerkiksi plasmidiin). Niiden avulla voidaan myös tarkistaa, onko haluttu geeni liittynyt vektoriin oikein. DNA:han voidaan myös suunnitella ja kohdennetun mutageneesin avulla toteuttaa uusia katkaisukohtia halutuille restriktioentsyymeille.

Restrikioentsyymin annetaan vaikuttaa näytteeseen tietyn ajan tietyssä lämpötilassa (kullekin entsyymille on omat optimaaliset olosuhteensa). Yleensä reaktion tulosta tarkastellaan agaroosigeelielektroforeesin avulla. Siinä erikokoiset DNA-palat erottuvat kokonsa mukaan ja niiden kokoa voidaan havainnoida vertaamalla standardinäytteeseen, jossa on tunnetun kokoisia DNA-palasia. Joskus halutaan myös kartoittaa vektorin ja sisältämän insertin (lisätyn DNA-jakson) sisältämät restriktioentsyymien katkaisukohdat (restriktiokartoitus). Tämä selvitetään antamalla eri entsyymien vaikuttaa DNA:han ja havainnoimalla sitten geelielektroforeesilla syntyneet DNA-jaksot.