 |
Gradientcentrifugering |
Separering och rening av nukleinsyror
Det finns många olika metoder för rening av nukleinsyror. Om man till ett vattenlösligt prov tillför t.ex. en blandning av fenol och kloroform kommer proteinerna att denaturera och falla ut på gränsen mellan fenol-kloroform och vattenlösningen. Nukleinsyrorna förblir i vattenlösningen.
Med starka saltlösningar får man också proteiner att falla ut.
Med hjälp av t.ex alkohol (etanol eller isopropanol) kan man få nukleinsyror i ett prov att falla ut. Orenheterna förblir då i lösningen. Fällningen av nukleinsyror kan lösas på nytt i en ren buffertlösning. Nu kan man också passa på att göra en mer koncentrerad lösning av nukleinsyrorna genom att lösa dem i en mindre volym buffert. Nukleinsyror faller ut som salter. Fällningen bör därför göras i närvaro av både alkohol och någon katjon (t.ex. Na-acetat).
Centrifugering i en CsCl-täthetsgradient används för rening av nukleinsyror. Vid centrifugeringen vandrar de tunga ceciumjonerna mot rörets botten och en täthetsgradient uppkommer (tätare i botten och mindre tätt på ytan). De olika formerna av nukleinsyror placerar sig i täthetsgradienten enligt hur mycket etidiumbromid bundits till dem. Etidiumbromid är lättare än ceciumklorid, vilket innebär att ju mindre etidiumbromid som finns bundet till en molekyl desto tyngre är den och desto djupare i gradienten trycks den av centrifugalkrafterna. På detta sätt kan man isolera plasmid-DNA, kromosomalt DNA och RNA från varandra. Kromosomalt DNA binder mest etidiumbromid och är därmed lättast, plasmidens superspiral binder inte mycket etidiumbromid och är därför lite tyngre och enkelsträngat RNA binder endast lite etidiumbromid och kommer därför att hamna i rörets botten.
Av de kromatografiska metoderna används främst gelfiltrering, jonbyteskromatografi, eller selektiv bindning. Gelfiltrering bygger på att enskilda molekyler diffunderar genom gelkolonnen med olika hastighet. Inom jonbyteskromatografin utnyttjar man nukleinsyrornas starka negativa laddning. Vid selektiv bindning låter man nukleinsyrorna binda till silikagel. Orenheterna tvättas bort och nukleinsyrorna lösgörs från silikagenen med hjälp av en lösning med låg jonstyrka. I många komersiella reningskit förekommer silikagel på en membran som ligger på kolonnen, genom vilken provet och tvättlösningarna centrifugeras.
Bilden visar till vänster:
Fenol-kloroformextrahering: 1. prov i vattenlösning; 2. fenol-kloroform tillsätts; 3. allt blandas och det uppstår en emulsion där proteinerna faller ut på fasgränserna, 5. faserna avskiljs, proteinfällningen blir på fasytan; 6. de rena nukleinsyrorna finns i vattenfasen.
Till höger:
Silikarening: 1. kolonn med silikamembran; 2. provet tillsättts (buffert med hög jonkoncentration), nukleinsyror = röda; orenheter = gröna; 3. vätskan centrifugeras bort; 4. tvättlösning tillsätts och centrifugeras bort, med tvättlösningen avlägsnas orenheterna, nukleinsyrorna ligger på silikamembranen; 5.de rena nukleinsyrorna elueras bort (buffert med låg jonstyrka)
