Mikroteknik
Färgningsmetoder
Färgningsmetoder
AVFÄRGNING ELLER DIFFERENTIERING
Snitt kan avfärgas på olika sätt.
1. Överskott av betmedel
Vid denna behandling frigörs färg från färg-betmedelsföreningen i vävnaden. Färgen vandrar ut i betmedlet. För lång tid i betmedlet avlägsnar all färg. Vanligen binder kärnorna mera färg än cytoplasmat, som därför avfärgas först. Detta är ofta det önskade resultatet. Behandlingen avbryts genom tvätt i rinnande vatten. Detta är mycket viktigt annars fortsätter avfärgningen och snitten bleknar helt och hålllet.
2. Behandling med syror
Syror avlägsnar färgen effektivt men mekanismen bakom är inte helt känd.
3. Oxidationsmedel
Färgen oxideras till färglös form. Denna metod är långsam och möjliggör uppkomsten av nyanser och färgtoner. Pikrinsyra används ofta.
DEPARAFFINERING, HYDRERING OCH FÄRGNING
Ordna allt färdigt innan du börjar!
Proceduren är följande:
1. Objektglasen radas med baksidorna mot varandra in i en glashållare.
2. Glasen förs genom en sjunkande alkoholserie: xylol I; xylol II; 100% alk; 96% alk; 80% alk; 70% alk; 50% alk; 20% alk; dest vatten. Xylolbaden skall vara 5 min, de övriga ca 3 min.
Denna behandling är motsatsen till vad du gjorde före inbäddningen i vax. Nu måste vaxet bort för att färgen skall fastna. Som du ser använder man samma vätskor. Det hela går snabbare för att snitten är så tunna.
3. När preparaten nått dest vatten är de färdiga för själva färgningen.
Här kommer recept på två vanliga histologiska färgningar.
Hematoxylin - Eosin
a. preparaten deparaffineras och hydreras
b. Delafields Hematoxylin utspädd: 4 ml hematoxylin + 200 ml vatten, 4 timmar
c. rinnande vatten, 5-10 min
d. Eosin (gelblich) 0,5%, 5 min
e. rinnande vatten, 1 min
f. 80% alkohol och vidare mot högre alkoholer och montering
g. resultat: kärnor mörkblå; cytoplasma svagt rosa
Heidenhains Azan
a. preparaten deparaffineras och hydreras
b. Azokarmin (i väl tillslutet kärl vid +56-60°C) 45-60 min
c. glasen får svalna vid rumstemperatur 5-10 min
d. sköljning i dest vatten
e. differentiering i anilinlösning. (När kärnorna börjar framträda avbryts differentieringen).
f. sköljning i ättiksur alkohol 1,5-2 min. (Är preparaten för röda kan de flyttas tillbaka till anilinlösningen).
g. Fosforwolframsyra 1-3 timmar
h. sköljning i dest vatten
i. Anilinblå-orange lösning 1-3 timmar
j. sköljning i dest vatten
k. differentiering i 96% alkohol. (Preparat med mycket känsliga fina trådar sköljes inte i dest vatten, utan förs direkt till 96% alkohol)
l. dehydrering i 100% alkohol, klarning och montering
m. resultat: kollagena och retikulära trådar - starkt blå; kromatin - rött; muskel - rödaktig till orange; röda blodkroppar - röda; neuroglia - rödaktig; slem - blått; granula - gula, röda eller blå
4. När preparaten är färdigt färgade skall de göras permanenta.
5. Glasen förs nu genom en stigande alkoholserie: 20% alk; 50% alk; 70% alk; 96% alk; 100% alk I; 100% alk II; xylol. Alla bad bör räcka minst 3 min.
6. OBS! Om färgningsreceptet direkt säger vilken styrka på alkoholen man skall börja med skall man naturligtvis följa detta råd och inte börja vid lägre styrka.
7. När glasen nått xylol badet, lyfts de ett i gången ur xylolbadet och placeras vågrätt på en pappershandduk på bordet. En droppe Permount placeras på glaset och ett täckglas placeras försiktigt på. Täckglaset sjunker fint ner på objektglaset och Permount breder ut sej under. Glasen placeras nu i värmeugn (+37°C) över natten. Detta för att monteringmedlet skall stelna.
Nu är dina snitt färdiga och hoppeligen fina.
Litteratur:
Gretchen L. Humason. 1972. Animal Tissue Techniques. W.H. Freeman & Company, San Francisco.
Gertraude Moewis. 1978. Histopatologisk teknik. Almqvist & Wiksell Förlag Stockholm
Benno Romeis. 1968. Mikroskopische Technik. R. Oldenbourg Verlag, München, Wien.
