 |
Nukleiinihappojen geelielektroforeesi |
Sangerin menetelmä
Sangerin sekvensointimenetelmä (nk. dideoksimenetelmä) on entsymaattinen menetelmä DNA:n sekvensoimiseen. Siinä hyödynnetään DNA-polymeraasin toimintaa ja muokattuja nukleotidejä, dideoksinukleotidejä. DNA-polymeraasi ei pysty liittämään uutta nukleotidia dideoksinukleotidin jälkeen, joten synteesi pysähtyy. Kun DNA-polymeraasin annetaan syntetisoida DNA:ta neljässä koeputkessa niin, että jokaisessa koeputkessa on sekä kaikkia normaaleja nukleotidejä että yhtä dideoksinukleotidiä, katkeaa synteesi kussakin koeputkessa aina tietyn emäksen kohdalla (A, T, C, tai G). Dideoksinukleotidiä on reaktioseoksessa vain vähän, joten synteesi loppuu satunnaisesti eri kohdassa sekvenssiä olevan emäksen kohdalla ja syntyy useita erimittaisia DNA-palasia. Kun näytteet polymeraatioreaktion jälkeen erotellaan geelielektroforeesilla, voidaan kussakin koeputkessa syntyneiden DNA-fragmenttien pituudesta päätellä DNA-sekvenssin emäsjärjestys.
Alkuperäisen Sangerin menetetelmän heikkous on se, että DNA:n pitää sekvensointia varten olla yksijuosteista. Menetelmästä onkin kehitetty uusia versioita mm. yhdistämällä se PCR:n kanssa. Näin saatu nk. syklinen sekvensointi voi käyttää lähtöaineena suoraan kaksijuosteista DNA:ta. Näytettä myös tarvitaan vain vähän, koska PCR:n avulla samaa lähtöjuostetta voidaan syntetisoida useaan kertaan. PCR:stä poiketen käytetään tosin vain yhtä aluketta, jotta vain toinen juoste polymerisoituu yhdellä kerralla. Syklinen sekvensointi on nykyisin yleisesti käytössä.
Sekvensoinnin luotettavuuden lisäämiseksi sekvensoidaan usein molemmat DNA:n juosteet. Sekvensointi suoritetaan usein liittämällä tutkittava DNA-jakso tunnettuun plasmidiin, jolloin plasmidiin sitoutuvilla alukkeilla voidaan sekvensoida mikä tahansa tuntematon, plasmidiin liitetty DNA-jakso (ei siis tarvitse tehdä alukkeita, jotka kiinnittyisivät suoraan tutkittavaan DNA-jaksoon).
Nk. automaattinen sekvensointi hyödyntää fluoresoivien leimojen käyttöä. Tällöin kukin nukleotidi (tai kunkin nukleotidin reaktiossa käytetty aluke) on merkattu omalla aallonpituudella fluoresoivalla leimalla (ts. omalla värillä). Reaktioiden jälkeen kaikki neljä reaktioseosta yhdistetään ja ajetaan geelielektroforeesilla erityisellä laitteella, joka detektoi geelin alaosassa ohitseen kulkevat fluoresoivat leimat. Koska lyhyemmät DNA-palat kulkevat geelillä nopeammin ja pidemmät hitaammin, laite havaitsee DNA-jaksot kokojärjestyksessä, tunnistaa ne niiden leimauksen mukaan ja ilmoittaa suoraan sekvenssin. Automaattisen sekvensoinnin etuja on mm. se, että sillä saadaan kerralla sekvensoitua pitkä jakso DNA:ta. Erityisen pitkiä DNA-jaksoja sekvensoidaan silti useina, osittain päällekkäisinä jaksoina.
