not available fi se
not available 2 not available
www.solunetti.fi
Etusivu / Tutkimus / Molekyylibiologisia menetelmiä / Nukleiinihappojen monistaminen
taso 2

Nukleiinihappojen monistaminen

PCR eli polymeraasiketjureaktio (polymerase chain reaction) on joustava tapa DNA:n kopiointiin. PCR mahdollistaa yksittäisen DNA-molekyylin monistamisen miljooniksi kopioiksi. DNA:n eksponentiaalinen monistaminen PCR:n avulla on mahdollista kuumissa lähteissä elävistä mikrobeista löydetyn, lämpöä kestävän DNA-polymeraasin vuoksi. Kary Mulliksen 1983 keksimä tekniikka on lukuisine versioineen nykyisin yleisesti käytössä biologian ja lääketieteen alan laboratorioissa. 

PCR mahdollistaa DNA:n monistamisen lisäksi myös sen muuttamisen suunnitellulla tavalla. PCR:n avulla voidaan esimerkiksi lisätä DNA:han katkaisukohta restriktioentsyymille tai mutatoida tiettyjä emäksiä DNA:sta ja sitä kautta niitä vastaavia aminohappoja geenin koodaamasta proteiinista.

Yleisimmillä PCR-tekniikoilla voidaan yleensä kopioida korkeintaan noin 10 kb kokoisia DNA-fragmentteja. Reaktio tarvitsee toimiakseen monistettavan DNA:n, alukkeet, DNA-polymeraasin, nukleotidejä, puskuriliuoksen ja ioneja. Reaktio tapahtuu pienessä tilavuudessa koeputkessa, laitteessa, joka lämmittää ja jäähdyttää koeputkia halutun sarjan mukaisesti. Useimmiten PCR:ssä on 20 - 35 kolmivaiheista sykliä. Ensimmäinen kolmesta vaiheesta on aloitusvaihe, jossa reaktioseoksen lämpötila nostetaan niin korkealle (esim. 95 °C), että DNA denaturoituu (juosteet irtoavat toisistaan, kuvassa vaihe 1). Toisessa vaiheessa lämpötilaa lasketaan niin, että alukkeet voivat sitoutua yksijuosteisiin DNA-molekyyleihin (2). Tämä lämpötila (usein 50 - 64 °C) riippuu alukkeiden ominaisuuksista. Kolmannessa vaiheessa lämpötila nostetaan DNA-polymeraasin toiminnalle optimaaliseksi (esim. 72 °C), jolloin DNA-polymeraasi syntetisoi yksijuosteisesta DNA:sta kaksijuosteista DNA:ta (3). Viimeisen syklin kolmas vaihe on usein normaalia pidempi, jotta kaikki DNA-juosteet on varmasti polymerisoitu loppuun saakka.