not available fi not available
not available 2 not available
www.solunetti.fi
taso 2

Nukleiinihappojen leimaus

Monissa molekyylibiologisissa tekniikoissa, erityisesti hybridisaatiotekniikoissa, käytetään leimattuja nukleiinihappoja. Haluttuun sekvenssiin sitoutuvia leimattuja oligonukeotidejä kutsutaan koettimiksi.

Yksittäisiä nukleotidejä ja oligonukleotidejä voidaan leimata monin erilaisin menetelmin. Nukleotidit voidaan leimata radioaktiivisen fosforin (isotooppi 32P) tai rikin (isotooppi 35S) avulla, jolloin hybridisaation jälkeen tulos havainnoidaan röntgenfilmillä. Muissa kuin radioaktiivisissa leimausmenetelmissä nukleotidiin kiinnitetään kovalenttisesti jokin merkkiaine. Merkkiaine voi olla esimerkiksi fluoresoiva väriaine, spesifisen vasta-aineen avulla havaittava digoksigeniini (DIG) tai biotiini. Biotiini havaitaan yleensä avidiinin (tai streptavidiinin) avulla. Biotiini on pieni, orgaaninen molekyyli ja avidiini siihen sitoutuva proteiini - biotiinin ja avidiinin välinen sitoutuminen on vahvimpia luonnosta löydettyjä ei-kovalenttisia sidoksia. Avidiiniin voidaan liittää merkkiaine, esimerkiksi alkaalinen fosfataasi.

Leimauksissa käytettävät entsyymit, kuten alkalinen fosfataasi ja piparjuuriperoksidaasi, tuottavat värittömistä substraateista helposti havaittavia lopputuotteita. Tällainen entsyymi voidaan kiinnittää välillisesti oligonukeotidiin, jolloin koettimen paikantama sekvenssi havaitaan entsyymireaktion jälkeen.

Nukleotidien ja oligonukleotidien lisäksi myös DNA:ta ja RNA:ta voidaan leimata. DNA:ta leimataan DNA-polymeraasin avulla. Polymeraasi  voi liittää leimattuja nukleotidejä DNA:han joko denaturoitua DNA:ta syntetisoidessaan tai DNA:n toiseen juosteeseen tehtyjen katkosten kohtiin. DNA:ta voidaan leimata myös vain päistä; esimerkiksi kohessiivisella restriktioentsyymillä katkaistua DNA:ta voidaan leimata DNA-polymeraasin ja leimattujen nukleotidien avulla. RNA:ta leimataan lähinnä in vitro transkription avulla, jossa plasmidiin vietyä sekvenssiä tuotetaan RNA-polymeraasin avulla leimatuista nukleotideistä.